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基于siRNA/miRNA的高通量篩選

我們的策略是直接在功能上研究,通過siRNA沉默候選基因篩選得到功能基因。siRNA和藥物聯(lián)合使用可以篩選到能夠起增敏作用的靶基因。這些數(shù)據(jù)為靶向治療和聯(lián)合用藥提供了重要依據(jù)?;谌蚪MsiRNA文庫的高通量篩選,可平行分析成千上萬條基因功能,大大加快研究進程,從而能迅速、全面地鑒定出細胞過程或信號傳導(dǎo)途徑的相關(guān)基因,以及疾病相關(guān)的藥物靶基因,保證研究成果更為系統(tǒng)和新穎。

技術(shù)介紹

基于多孔板和液體工作站的篩選方法

預(yù)先將siRNA文庫里各條siRNA分別與轉(zhuǎn)染試劑混合,轉(zhuǎn)移到384或96微孔板中,然后將培養(yǎng)好的細胞接種到微孔板里,細胞被轉(zhuǎn)染siRNA。經(jīng)過48-72小時的培養(yǎng),蛋白表達水平被沉默后,通過高通量的微孔板讀數(shù)儀或高內(nèi)涵掃描顯微鏡讀出孔板里的細胞信號。若這些細胞信號與參照組相比發(fā)生了顯著變化,則認為相應(yīng)的siRNA與研究的細胞過程相關(guān),從而鑒定出相關(guān)的候選基因

自組裝細胞芯片篩選技術(shù)

除了傳統(tǒng)的孔板篩選服務(wù)外,篩選平臺針對大規(guī)模篩選需求,成功開發(fā)出先進的自組裝細胞芯片技術(shù)(Self-assembled Cell Microarray,SAM cell)。在玻璃蓋玻片上,利用微加工技術(shù)(micro-fabrication)使細胞自組裝形成細胞小島微陣列,高集成化的微陣列極大地提高了篩選通量。同時采用反向轉(zhuǎn)染技術(shù),簡化了轉(zhuǎn)染過程,延長了保存時間,這將大大減少篩選中使用的siRNA和相應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑。SAM cell技術(shù)已經(jīng)大量應(yīng)用于siRNA文庫、質(zhì)粒文庫及化合物文庫的高通量篩選。

SAM cell技術(shù)流程

在芯片上點印siRNA、質(zhì)?;蛘呋衔铮臃N細胞后,細胞在自組裝形成細胞島點陣,同時相應(yīng)位置上點印的內(nèi)容自動轉(zhuǎn)染到對應(yīng)的細胞小島,最后通過高內(nèi)涵圖像掃描系統(tǒng)成像,分析實驗結(jié)果。

細胞島間無交叉污染

在25x25mm的蓋玻片上,細胞在自組裝形成點陣的同時轉(zhuǎn)染表達GFP的質(zhì)粒,細胞小島間隔形成熒光點陣,而相鄰的細胞小島(沒有轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒)則沒有熒光信號。

成功案例

1、已知藥物功能篩選其增敏靶點

篩選策略:

1.   明確該藥物功能,明確該藥物藥效的dose curve。

2.   選取與此項功能相關(guān)的信號通路,設(shè)計合成siRNA,建立文庫。每個基因設(shè)計合成3條siRNA。如涉及面廣,可直接使用全基因組siRNA文庫。如果小規(guī)模試篩,可以考慮選取激酶siRNA文庫,700個基因。

3.   開展篩選工作:低劑量的藥物與siRNA文庫共篩,以高劑量藥物作用組為正對照,鑒定出增敏效果的siRNA。

4.   根據(jù)增敏結(jié)果,結(jié)合生物信息學(xué)分析,推斷出藥物增敏靶點以及藥物作用的信號通路,甚至是藥物直接作用的靶基因。

2、已知功能基因篩選調(diào)控該基因的miRNA

篩選策略:

1.   人類miRNA mimics文庫構(gòu)建:約1100條,或由客戶定制。

2.   熒光素酶報告基因載體構(gòu)建:根據(jù)目的基因3’UTR的長度而定,一般每300-800bp構(gòu)建一個載體。

3.   篩選:建議使用Hela細胞系,或目標(biāo)細胞系,96孔板篩選。

每個報告基因載體都要將miRNA文庫篩選一遍。

每孔共轉(zhuǎn)染報告基因質(zhì)粒,miRNA mimics,內(nèi)參renilla質(zhì)粒。以不干擾任何基因的siRNA NC 為陰性參照。

48小時后裂解細胞,使用酶標(biāo)儀測量luciferase活性?;钚越档偷臑殛栃詍iRNA。

現(xiàn)貨孔板文庫信息

成品文庫信息:

1.  人類全基因組siRNA文庫:約21000 個基因,每個基因?qū)?yīng)3條siRNA,分別為A,B,C三個亞庫。

siRNA序列設(shè)計參考美國著名siRNA生產(chǎn)商,3'末端采用特殊修飾。

分裝在384孔板中,規(guī)格為每孔5-8pmol,氬氣保護,鋁膜封裝,-80度儲存。

報價:總價25W,單買一個亞庫10W。

貨期:1周。

 

2.   人類激酶siRNA文庫:約700個基因,每個基因?qū)?yīng)3條siRNA,分別為A,B,C三個亞庫。

siRNA序列設(shè)計參考美國著名siRNA生產(chǎn)商,3'末端采用特殊修飾。

分裝在96孔板中,規(guī)格為每孔20-25pmol,氬氣保護,鋁膜封裝,-80度儲存。

報價:總價8W,單買一個亞庫3W。

貨期:2-3周。

 

3.   人類磷酸化酶基因siRNA文庫:約300 個基因,每個基因?qū)?yīng)3條siRNA,分別為A,B,C三個亞庫。

siRNA序列設(shè)計參考美國著名siRNA生產(chǎn)商,3'末端采用特殊修飾。

分裝在96孔板中,規(guī)格為每孔20-25pmol,氬氣保護,鋁膜封裝,-80度儲存。

報價:總價4W,單買一個亞庫1.5W。

貨期:1-2周。

 

4.   人類miRNA模擬體文庫:約1100 個miRNA

序列參考miRbase, 3'末端采用特殊修飾。

分裝在96孔板中,規(guī)格為每孔20-25pmol,氬氣保護,鋁膜封裝,-80度儲存。

報價:6W。

貨期:2-3周。

 

5.   FDA認證化合物文庫:約1000個化合物。

DMSO溶解,分裝在96孔板中, -80度儲存。

詢價。

參考文獻:

1 Whitehurst A W ,Bodemann B O , CardenasJ , et al. Synthetic lethal screen identification of chemosensitizer loci incancer cells[J]. NATURE, 2007, 446(7137):815-819.

2.  Junyu Yang, Milton E. Brown, HanshuoZhang, et al. High-throughput screening identifies microRNAs that target Nox2and improve function after acute myocardial infarction[J].Am J Physiol HeartCirc Physiol, 2017,312: H1002–H1012.

 

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