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LncRNA

LncRNA(long non-codingRNAs)長(zhǎng)鏈非編碼RNA是一類長(zhǎng)度大于200nt但不編碼蛋白質(zhì)的RNAs,廣泛存在于動(dòng)植物中。在生物的生命活動(dòng)過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用,LncRNA測(cè)序針對(duì)有參考基因組樣本開(kāi)展準(zhǔn)確的lncRNA鑒定和lncRNA靶基因預(yù)測(cè),同時(shí)提供針對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)中mRNA的分析結(jié)果,更廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)研究領(lǐng)域。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)

 · 周期短,通量高,信息全;

 · 不限于對(duì)已知lncRNA的研究分析,并設(shè)置嚴(yán)格的篩選條件預(yù)測(cè)新的lncRNA;同時(shí)可得到mRNA數(shù)據(jù),可開(kāi)展lncRNA與mRNA的關(guān)聯(lián)分析,深入分析 lncRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò);

 · 利用高通量測(cè)序技術(shù),可以一次性獲得單堿基分辨率的lncRNA序列信息,有利于提高后續(xù)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和綜合性;

 · 可以對(duì)包括人類、動(dòng)植物在內(nèi)的許多物種的lncRNA進(jìn)行鑒定和分析。

服務(wù)流程

樣本要求

樣本類型

樣本要求

保存及運(yùn)輸條件

說(shuō)明內(nèi)容

新鮮組織

新鮮組織標(biāo)本(腫瘤樣本在術(shù)后30分鐘內(nèi)取得)≥50 mg(黃豆粒大小)可采用以下方法:

1.RNAlater:尤其適用于腫瘤組織,離體后于冰上快速切成小塊,組織塊直徑最好介于1-5 mm(小米至綠豆大?。菰?倍體積的RNAlater中,充分浸潤(rùn)(最好4℃過(guò)夜,以保證浸潤(rùn)效果),-80℃保存;如果是腫瘤樣本,應(yīng)盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤組織和正常組織。

2.TRIzol:在冰上快速分成小塊,組織塊直徑最好不大于5 mm(綠豆大?。┙萦赥RIzol中,凍存管或者離心管封口膜封好后送樣。

3.液氮:離體后液氮速凍充分,預(yù)冷凍存管,將組織轉(zhuǎn)移至凍存管中,液氮可長(zhǎng)期保存。

干冰運(yùn)輸

建議樣本備份1-2份,收樣后立即提取。

細(xì)胞

提取mRNA需細(xì)胞數(shù)量>5×106個(gè),lncRNA需>1×107個(gè)。

1.懸浮細(xì)胞收集用PBS緩沖液快速洗一次,每5×106個(gè)細(xì)胞加入1 mL TRIzol,用移液器吹散,溶液呈清亮不粘稠狀;-80℃保存不超過(guò)1個(gè)月;

2.貼壁細(xì)胞需將培養(yǎng)基盡量吸棄;按每10 cm2培養(yǎng)面積(相當(dāng)于六孔板一個(gè)孔或35 mm直徑培養(yǎng)皿)加1 mL TRIzol;移液器反復(fù)吹打,使TRIzol完全接觸長(zhǎng)有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶表面,充分消化;轉(zhuǎn)移到RNase-free的離心管中,用一次性注射器反復(fù)吹打細(xì)胞直至看不見(jiàn)成團(tuán)的細(xì)胞塊,整個(gè)溶液呈清亮不粘稠狀,-80℃保存。

干冰運(yùn)輸

建議樣本備份1-2份,收樣后立即提取。

外周血(RNA

1.TRIzol:15 mL管中加入6 mL TRIzol和2 mL新鮮血液(TRIzol:血液=3:1),移液器吹打以幫助裂解樣品中的細(xì)胞;樣品劇烈震蕩混勻1-2 min,直到絮狀物全部溶解;室溫孵育5 min使核蛋白體完全分解;封口膜封存,-80℃凍存。

注意:冰凍血液溶解過(guò)程中會(huì)有破碎的細(xì)胞釋放RNA酶,因此建議在冰凍前加入TRIzol,切勿直接凍存新鮮血液,保存好的血液應(yīng)避免反復(fù)凍融。離心得到白細(xì)胞或有核細(xì)胞,可加TRIzol,-80℃保存,干冰運(yùn)輸。

2.BD PAXgene Blood RNA Tube:人類血液樣本推薦使用,采集量為2mL左右,18-25℃可保存3天,2-8℃可保存5天,-20℃或-70℃至少可穩(wěn)定50個(gè)月。

3.使用RNAlock血液RNA穩(wěn)定劑保存,新鮮抗凝血液:血液RNA穩(wěn)定劑=1:3,蓋上管蓋,上下顛倒混勻8-10次。室溫放置2h以上后低溫保存;含有血液RNA穩(wěn)定劑的人血液樣品可在2-8℃保存5天,或在-20℃條件下至少保存三個(gè)月;含有血液RNA穩(wěn)定劑的哺乳動(dòng)物血液樣品可在15-25℃保存2天,2-8℃保存7天,或在-20℃條件下至少保存六個(gè)月。

TRIzol保存法需干冰運(yùn)輸;BD PAXgene Blood RNA Tube保存法可使用足量冰袋,用泡沫箱運(yùn)輸

 

TotalRNA

總RNA溶解于DEPC水或者RNase-free的緩沖液中。純度OD260/280≥2.0;濃度≥100 ng/μL。

所需樣本量與樣本降解程度,即RIN值的大小有關(guān):RIN≥8.0,總量≥3 μg;RIN在6.0-8.0之間,總量≥4 μg;RIN<6.0,總量≥6 μg。lncRNA測(cè)序采用ribo-zero方法去除rRNA。RIN<6.0的降解比較嚴(yán)重的RNA樣本建議采用Ribo-Zero方法建庫(kù),不建議用TruSeq方法。

使用1.5 mL或2 mL離心管盛放,用parafilm封口膜密封,然后將樣本管置于保護(hù)用的50 mL離心管或其他類似容器里,并旋緊蓋子。使用足量冰袋,用泡沫箱運(yùn)輸。

Ribo-Zero法適用于降解樣本(低RIN值)RNA測(cè)序、lncRNA測(cè)序等。

 

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